Modificaci贸n al azar del genoma en bacterias

Las bacterias son uno de los organismos m谩s utilizados a lo largo de la historia de la biolog铆a, permiti茅ndonos hacer importantes descubrimientos sobre procesos moleculares, metab贸licos, gen茅ticos, etc.

Genoma de bacteria y biologia

Estos descubrimientos y estudios se han podido llevar a cabo gracias a las t茅cnicas de modificaci贸n gen茅tica que nos han dado la opci贸n de dise帽ar bacterias con las caracter铆sticas necesarias.

– Elementos transponibles y modificaci贸n al azar

Los elementos transponibles son elementos gen茅ticos capaces de transportarse de un punto a otro de un replic贸n o entre dos replicones de forma independiente de la recombinaci贸n hom贸loga.

La transposasa, codificada en el propio transpos贸n, escinde al elemento transponible de su localizaci贸n y lo inserta en otro punto distinto. Estos elementos transponibles son muy variables en estructura y suelen estar limitados por secuencias repetidas, que act煤an de diana espec铆fica de la transposasa. Adem谩s, pueden transportar otros genes que confieren diversos fenotipos.


+ Mecanismos de transposici贸n

Cuando el mecanismo es de transposici贸n conservativa, el transpos贸n se relocaliza en la c茅lula sin dejar copia, creando una mol茅cula da帽ada o que se digiere por ser lineal, lo que genera problemas.

Cuando el mecanismo es de transposici贸n replicativa, el transpos贸n se relocaliza dejando una copia en el lugar. Durante la transposici贸n se crea una mol茅cula integrada que luego se escinde para dar dos mol茅culas. Suelen llevar una recombinasa que reconoce las zonas repetidas y genera una recombinaci贸n espec铆fica de sitio (SSR).

La reacci贸n de la transposasa en realidad son dos reacciones, una escisi贸n y una uni贸n. Los transposones que realizan la transposici贸n conservativa escinden en doble cadena, mientras que los que hacen transposici贸n replicativa generan cortes de cadena sencilla que luego permiten la formaci贸n del cointegrado.

En la inserci贸n, todos los transposones tienen una diana. La transposasa reconoce y se una a la diana, y genera dos cortes de cadena sencilla y se inserta. En el hueco que queda a ambos lados, la propia c茅lula lo rellena. Esto permite reconoce la diana del transpos贸n, ya que a ambos lados del mismo encontramos la misma secuencia.

– Mutag茅nesis con transposones

Los transposones son agentes mutag茅nicos, ya que pueden irrumpir en un gen y hacer que pierda su funci贸n, aunque a veces pueden mantenerse si se introduce al final de un gen y no afecta demasiado.

Muchos de estos elementos saltan al azar porque sus dianas son muy peque帽as en nucle贸tidos, o est谩n muy degeneradas (poseen grandes grupos de dianas). Las que se usan en ingenier铆a gen茅tica tienen dianas muy generadas, lo que permiten que casi puedan unirse al azar a cualquier lugar del genoma. Esto permite su inserci贸n en cualquier gen no esencial (ya que, si es esencial, la c茅lula no crecer铆a). Adem谩s, en ingenier铆a gen茅tica se suelen usar marcadores seleccionables que van siempre asociados al transpos贸n.

Cuando un transpos贸n se inserta en un oper贸n, normalmente genera mutaciones que son polares sobre los genes distales. Si un transpos贸n se inserta en uno de los genes (A), aborta la transcripci贸n y no se crea mensajero, lo que impide que se expresen los genes B y C. (genotipo A-, B- y C-). Si se diese en B, por ejemplo, ser铆a A+. B- y C-.

Los transposones naturales pueden saltar repetidas veces, y no tienen por qu茅 quedarse donde primeramente se insertaron (transposici贸n secundaria), y provocar mutaciones adicionales.


+ Minitransposones

Los minitransposones son derivados de los transposones, construidos artificialmente y que no llevan la transposasa en el elemento transponible. La transposasa es un elemento activo en trans, lo que permite que se pueda proporcionar desde fuera del elemento. Al no llevar transposasa, estos minitransposones no presentan transposici贸n secundaria.

+ Transposomas

Los transposomas son preparaciones hechas in vitro de un transpos贸n, con la transposasa unida covalentemente a sus extremos. Estos complejos se introducen en el hospedador a por electroporaci贸n y se transponen de forma muy eficaz.

Estos sistemas son especialmente 煤tiles para organismos que no poseen sistemas gen茅ticos o que no son capaces de expresar la transposasa.

Su funcionamiento se ha probado en m谩s de 30 estirpes bacterianas Gram+ y Gram- as铆 como en levaduras. Para seleccionar los mutantes deseados puede hacerse una selecci贸n directa (aunque no es lo m谩s com煤n) o por selecci贸n de inserciones (antibi贸ticos o marcadores seleccionables) y luego mediante pruebas fenot铆picas.

+ Transposici贸n in vitro

Para muchos transposones, la reacci贸n de transposici贸n se puede reproducir in vitro en presencia de una transposasa purificada y el ADN diana. Puede usarse como alternativa para mutagenizar genomas completos usando ADN cromos贸mico como diana, o genes concretos clonados en un pl谩smido.

El material mutagenizado se reintroduce en el hospedador por electroporaci贸n para poder conocer c贸mo se ha insertado y, en caso de que sea posible, el an谩lisis funcional de este material mutagenizado.

– Aplicaciones de los transposones

+ Fusiones g茅nicas

Se introduce el gen reporter en el fragmento del transpos贸n y se fusiona al gen cuya actividad se quiere medir, y como el promotor y la expresi贸n no se modifica, podemos conocer la expresi贸n y regulaci贸n del gen de inter茅s.

Existen dos tipos de fusiones, la fusi贸n transcripcional y la fusi贸n traduccional. En la fusi贸n transcripcional. En las fusiones traduccionales, el gen reporter est谩 fusionado al gen de inter茅s. La probabilidad de que se fusione depender谩 de si es transcripcional o traduccional. Si es transcripcional se insertar谩 en un 50% (el otro 50% es que entre del rev茅s). Si es traduccional, el reporter tiene que caer en la fase de lectura, es decir, 1/3. As铆, 1/2 x 1/3 = 1/6 de que se fusione correctamente.

Los ministransposones tambi茅n pueden usarse para la generaci贸n de fusiones g茅nicas. Estos minitransposones contienen un gen indicador sin promotor adyacente a uno de los extremos del transpos贸n. Cuando se insertan en la orientaci贸n adecuada, por detr谩s de un promotor, se genera una fusi贸n g茅nica cuantificable por la actividad del indicador. Algunos ministransposones generan fusiones traduccionales (prote铆nas de fusi贸n).


+ Expresi贸n condicional de genes

Se puede insertar en la regi贸n promotora un transpos贸n que lleve un promotor regulado, lo que te permite regular la expresi贸n del gen de inter茅s y observar su efecto, sobre todo en genes esenciales. Unos transposones que se usan para esto son los transposones TPOP, que poseen dos marcadores seleccionables y promotores en ambas direcciones.


+ Inserci贸n espec铆fica de sitio

Tn7 es un transpos贸n no compuesto que contiene genes de resistencia a trimetoprim (dhflr) y a estreptomicina (aadsAI). Tiene una transposasa compuesta producto de cinco genes (tnsA-E).

Posee una inserci贸n espec铆fica en un sitio 煤nico attTn7 que se encuentra en numerosas bacterias Gram negativas. Este attTn7 se localiza inmediatamente detr谩s del gen glmS, y su inserci贸n no causa ning煤n da帽o en la bacteria, ya que es una zona interg茅nica. Este transpos贸n se usa para introducir genes sin causar da帽os en la bacteria. Tolera fragmentos muy grandes.


+ Inserciones en fase con ministransposones

Estos minitransposones poseen en sus extremos un reporter y un marcador de resistencia, y adem谩s unos cuantos sitios de recombinaci贸n espec铆fica de sitio o dianas de restricci贸n. As铆, se puede eliminar el fragmento central.

Ahora, al eliminarse el fragmento introducido, queda una peque帽a inserci贸n que est谩 en fase y se conoce la secuencia. Si se usa un sitio de recombinaci贸n espec铆fica puede usarse, in vivo, una recombinasa que elimine la zona central. Esto se puede usar en estudios de estructura y funci贸n. La generaci贸n de una colecci贸n de inserciones en fase en el mismo gen permite determinar qu茅 regiones son permisivas y cu谩les no.

Con esto tambi茅n puede realizarse una inactivaci贸n proteol铆tica in vivo. As铆, se crean sistemas para inactivar una prote铆na r谩pidamente introduciendo en fase un fragmento que sea reconocido por una proteasa cuando se exprese la prote铆na pero que se encuentre en una zona permisiva. As铆, la prote铆na es funcional y se expresa, y con solo a帽adir la permeasa determinada, se inactive esta prote铆na.

Tambi茅n puede usarse para activaci贸n por recombinaci贸n. Mientras que el transpos贸n est谩, el gen est谩 inactivo, mientras que si se elimina este el proceso es irreversible. Un sistema, por ejemplo, que exprese una recombinasa espec铆fica de sitio cuando aparece un contaminante, eliminar铆a el transpos贸n y quedar铆a una marca (cicatriz gen茅tica) que nos indica que hubo contaminante en caso de que la exposici贸n sea transitoria.

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Art铆culo redactado por Pablo Rodr铆guez Ort铆z, Graduado en Biolog铆a por la Universidad de M谩laga.

Source: www.infobiologia.net

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