Herramientas diagn贸sticas para la Peste Porcina Africana

PMVZ. Elo铆sa A. Largo Fern谩ndez.

MVZ. MC. Rosalba Carre贸n N谩poles.
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Introducci贸n

La peste porcina africana (PPA) es una enfermedad muy contagiosa provocada por un virus ADN de la familia Asfaviridae, icosaedro, con envoltura, g茅nero Asfivirus que afecta a cerdos y jabalies (OIE 2018). Es end茅mica en algunos pa铆ses de 脕frica subshariana. Fue descubierta por primera vez en 1921 en Montgomery, Kenya, ya que causaba muertes entre cerdos europeos reci茅n llegados, y m谩s tarde en Portugal (1957) se describi贸 un brote que caus贸 la muerte del 100% de la piara de cerdos europeos, despu茅s de este suceso se logr贸 extender por toda la pen铆nsula ib茅rica y es hasta 1995 cuando se logr贸 su erradicaci贸n en la Uni贸n Europea.

Epidemiolog铆a

El cerdo es la 煤nica especie animal que es infectada por este virus de manera natural, pues los cerdos salvajes son reservorios de la enfermedad, mientras que los jabal铆es europeos presentan una infecci贸n subcl铆nica. La entrada del virus es v铆a oronasal aunque de igual manera puede ser v铆a contacto directo (cut谩nea), intramuscular, intravenosa o incluso por piquete de garrapata (Ornithodoros).

La replicaci贸n del virus se realiza en los ganglios linf谩ticos que est谩n cercanos al lugar donde entr贸 el virus y posteriormente se disemina a todo el organismo por v铆a venosa o linf谩tica llegando a 贸rganos como h铆gado, bazo y pulm贸n, donde realiza una segunda replicaci贸n que provoca la destrucci贸n de los vasos sangu铆neos y hemorragias.
Signos

El periodo de incubaci贸n var铆a desde 4 a 19 d铆as dependiendo de la v铆a de entrada y los signos dependen de la raza, estado f铆sico del cerdo y la virulencia del virus.

Entre ellos se encuentran:

  • Fiebre alta.
  • Hemorragias en piel y 贸rganos internos.
  • P茅rdida de apetito.
  • A diferencia de la Fiebre porcina cl谩sica no presenta signolog铆a nerviosa.

Se presenta muerte entre el 2 y 10 d铆a. La mortalidad y morbilidad es del 100% (CFSPH 2018).

Esta enfermedad se puede presentar de diferentes formas seg煤n su severidad:

a) Forma aguda: 100% mortalidad, fiebre (40.5-42掳C), hemorragias generalizadas, anorexia, cianosis, apat铆a y falta de coordinaci贸n.

b) Forma subaguda: Signos menos intensos que los del punto anterior, fiebre, anorexia, letargo, equimosis en piel, diarrea, dificultad para respirar y 煤lceras cut谩neas. Aborto en hembras y mortalidad cercana al 100%.

c) Forma cr贸nica: Sin signos, baja mortalidad, p茅rdida de peso, necrosis en zonas de piel, 煤lceras cut谩neas y artritis. Mayormente se presenta de 2 a 15 meses despu茅s de la exposici贸n al virus.

Hay que se帽alar que la mayor铆a de los animales que se recuperan quedan infectados, act煤an como portadores del virus y por esto es de gran importancia el diagn贸stico eficaz del virus en la piara.

La mejor estrategia de lucha contra la PPA debe basarse en la detecci贸n temprana de la enfermedad y en las decisiones adecuadas y efectivas para el control de la misma y la bioseguridad estricta, por lo que este art铆culo se basar谩 en las herramientas diagn贸sticas para esta enfermedad (OIE 2018).

Figura 2. Lesiones macrosc贸picas de la PPA. CFSPH. Peste Porcina Africana. USA; 2018.

La sospecha de la presencia de la enfermedad, inicialmente est谩 basada en la signolog铆a previamente mencionada, la cual debido sobre todo a la alta morbilidad y mortalidad pueden ser sugestivos a PPA, sin embargo, debido a la existencia de otras enfermedades que tienen signos y lesiones similares, el diagn贸stico deber谩 confirmarse con pruebas de laboratorio, seg煤n el C贸digo Sanitario para los Animales Terrestres y Manual de Pruebas de Diagn贸stico y Vacunas para los Animales Terrestres de la OIE (CResa 2010).

A) Diagn贸stico cl铆nico.
No es posible diferenciar entre la PPA y la Peste porcina cl谩sica mediante un examen cl铆nico o una necropsia e incluso se debe tener en cuenta otras enfermedades hemorr谩gicas presentes en el cerdo. En el examen cl铆nico se puede observar descargas nasales espumosas, de igual manera se puede observar 谩reas de hemorragia bien delimitadas e hiperemia perianal y exudados necr贸ticos (FAO, 2016).

El diagn贸stico diferencial incluye Peste porcina cl谩sica, S铆ndrome respiratorio y reproductivo, salmonelosis, erisipelosis y pleuropneumonia (enfermedades rojas), entre otras (S谩nchez, 2010).

B) Diagn贸stico de laboratorio.
Debido a las desventajas mencionadas, es necesario utilizar las pruebas de laboratorio para confirmar o descartar el diagn贸stico de PPA. Las muestras que se pueden enviar al laboratorio son: sangre completa con anticoagulante (EDTA), bazo, ganglios linf谩ticos, tonsilas y ri帽贸n. Durante el transporte las muestras deben permanecer lo m谩s fr铆as posibles sin congelar y ya en el laboratorio si el proceso para realizar el diagn贸stico tardar谩, se guardan a -70掳C (S谩nchez, 2018).

Pruebas para la Detecci贸n del virus

1) Aislamiento del virus
Se inoculan muestras de cerdos en cultivos de leucocitos o m茅dula 贸sea de cerdo principalmente, aunque de igual manera se pueden utilizar cultivos de macr贸fagos, algunas cepas producen hemoadsorci贸n de los eritrocitos porcinos en la superficie de las c茅lulas infectadas, la mayor铆a de estas cepas de virus no son virulentos, aunque producen la enfermedad con s铆ntomas. La desventaja de esto es obtener los cultivos y el proceso es sumamente lento para la obtenci贸n del resultado.

Figura 3. Aislamiento viral de PPA. FAO. Recogizing african swinw fever a field manual. IFAO, Italia; 2018.

2) Hemoadsorci贸n
De igual manera se puede detectar el virus en leucocitos de la sangre perif茅rica de cerdos infectados por medio de una prueba de hemoadsorci贸n. Se observa al microscopio una forma de m贸rula o corona de eritrocitos alrededor de los leucocitos. Este es el m茅todo m谩s eficaz, m谩s sensible y espec铆fico, pues ninguno de otros virus porcinos produce este efecto por lo que un resultado positivo es definitivo, aunque la desventaja es que es lento de obtener un resultado en comparaci贸n de otros m茅todos de diagn贸stico, pues se necesitan de al menos 5 a 10 d铆as para obtenerlo, aunque como se mencion贸 anteriormente existen algunas cepas de PPA no hemoadsorbentes y si es el caso deben realizarse pruebas como sedimento celular, mediante PCR o inmunofluorescencia directa, para confirmar la presencia del virus.

Figura 3. Hemoadsorci贸n de PPA. CRe Sa. African swine fever. CReSa. Italia; 2016

De acuerdo a la OIE existen dos m茅todos por lo que se puede llegar a obtener el diagn贸stico:

  • Hemoadsorci贸n en cultivos primarios de leucocitos.
  • Hemoadsorci贸n en auto-rosetas con leucocitos de sangre perif茅rica de cerdos infectados.

3) Inmunofluorescencia
Con esta t茅cnica se utiliza un conjugado fluorescente anti-virus PPA, con el cual se detecta al virus a partir de un frotis de tejido o en un corte con criostato y/o en la capa leucocitaria, de igual manera se puede utilizar sobre cultivos celulares infectados. Se observa al microscopio la presencia de c茅lulas infectadas con inclusiones citoplasm谩ticas de fluorescencia y cuando la infecci贸n es cr贸nica, la fluorescencia puede observarse con un aspecto granular, es importante se帽alar que si la infecci贸n ya ha sobrepasado los 10 d铆as y a煤n existan anticuerpos, 茅stos pueden bloquear el conjugado y por ende obtenerse un resultado falso negativo, por lo que puede realizarse una prueba de Inmunoblotting (detecci贸n de prote铆nas espec铆ficas del virus) (OIE 2018).

Figura 3. Inmunoflorescencia de la PPA. FAO. Recognizing african swine fever a field manual. FAO. Italia; 2016.

4) PCR.
Esta es una t茅cnica muy eficaz y espec铆fica donde se detecta la presencia del virus por la amplificaci贸n del ADN viral en la muestra, utiliza iniciadores dirigidos a la zona m谩s conservada del genoma y as铆 diferenciar cepas que hemoadsorben de las que no, adem谩s de cepas de baja virulencia. Por esta t茅cnica se puede obtener un resultado con muestras de sangre completa a partir del segundo d铆a de la infecci贸n y durante semanas m谩s tarde, y sobre todo puede detectar el virus algunos d铆as antes de la aparici贸n de los s铆ntomas.

Existen dos procedimientos por los cuales se pueden obtener los resultados:

  • PCR convencional.
  • PCR con Taq Man (OIE).

Aunque debido a la importancia de PPA, existen diversas pruebas de PCR que se han utilizado evaluando su sensibilidad y especificidad de acuerdo a diferentes prote铆nas del virus de PPA al que se dirigen, como lo muestra la figura 3.3.

5) ELISA.
Actualmente, de manera comercial, existen pruebas adaptadas para la detecci贸n del ant铆geno como la ELISA s谩ndwich o el Immunodot, pero son menos utilizadas pues su sensibilidad disminuye notablemente despu茅s de unos d铆as de ocurrido el ingreso del virus al cerdo.

Pruebas para la detecci贸n de anticuerpos.

Los anticuerpos contra el virus de PPA, persisten durante per铆odos prolongados despu茅s de la infecci贸n, se han desarrollado muchas pruebas serol贸gicas para el diagn贸stico, pero s贸lo unas pocas se han estandarizado para el uso de rutina en laboratorios de diagn贸stico. Las m谩s utilizadas son las siguientes:

1) Ensayo por inmunoabsorci贸n ligado a enzimas (ELISA).
ELISA se emplea actualmente utilizando un ant铆geno soluble que contiene gran parte de las prote铆nas del virus, esta t茅cnica es sencilla r谩pida y econ贸mica, y actualmente en el mercado se han desarrollado nuevos m茅todos de ELISAs con reactivos no infecciosos, donde se utilizan las prote铆nas recombinantes p32, p54, y pp62 como ant铆geno viral. Las muestras que salen positivas en esta prueba, deben de confirmarse con otras como inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.

2) Inmunofluorescencia indirecta (IFI).
Es una t茅cnica relativamente r谩pida en comparaci贸n a otras, tiene una alta sensibilidad y especificidad, donde se utilizan los anticuerpos espec铆ficos en el suero o exudados se hacen reaccionar sobre una monocapa celular infectado con el virus y la reacci贸n puede ser visualizada porque se a帽ade una prote铆na A marcada o un segundo anticuerpo anti IgG de cerdo conjugado con fluoresce铆na. Si es positiva la muestra, sobre la monocapa celular se encontrar谩n fluorescencias en puntos cercanos al n煤cleo y 茅stos ser谩n los centros replicativos del virus. Se utiliza como prueba confirmatoria sobre todo para zonas libres.

Comparaci贸n de PCR de PPA. Oura C.A. Diagn贸stico virol贸gico de Fiebre Porcina Africana. Estudio comparativo de pruebas disponibles. Elsevier. Trinidad y Tobago 2012.

3) Inmunoblotting.
Es una t茅cnica inmunoenzim谩tica que realiza reacciones del suero sospechoso, realizando la detecci贸n de anticuerpos espec铆ficos con prote铆na A/peroxidasa, permite determinar la reactividad de los anticuerpos en el suero poni茅ndolos a prueba contra distintas prote铆nas del virus de la PPA. Esta es una t茅cnica ideal para el diagn贸stico serol贸gico de confirmaci贸n de la PPA por su alta sensibilidad.

4) Inmunotransferencia.
Se puede utilizar como alternativa de la inmunofluorescencia indirecta para confirmar los resultados dudosos, esto gracias a polip茅ptidos en las tiras de ant铆geno que reaccionan con anticuerpos espec铆ficos a partir del 9 d铆a de la infecci贸n, por lo que es muy 煤til en muestras d茅bilmente positivas.

Con lo anteriormente descrito se debe se帽alar que la OIE y la FAO 煤nicamente recomiendan PCR ya sea Taq Man o convencional por ser una prueba molecular precisa con alta sensibilidad pues al amplificar en el material gen茅tico viral no necesita ser la muestra con alta carga viral, ELISA indirecta por ser una prueba serol贸gica eficaz, r谩pida, y relativamente de bajo costo, IFA e inmunotransferencia por ser pruebas serol贸gicas estandarizadas y que de igual manera tienen alta sensibilidad y el resultado se obtiene relativamente r谩pido (S谩nchez, 2010).

El diagn贸stico debe de ir paralelo a las medidas de bioseguridad y/o los programas de control que se establezcan en cada regi贸n con el fin de impedir la introducci贸n del virus de Peste Porcina Africana (VPPA).

Hay que se帽alar que la erradicaci贸n s贸lo puede ser colocando en cuarentena a la producci贸n y si el resultado de laboratorio resulta positivo se sacrifica a los animales infectados, los animales en contacto con ellos y la eliminaci贸n de los cuerpos por medio del entierro o incineraci贸n pues el VPPA puede sobrevivir por mucho tiempo en fomites y en el medio ambiente, y sobre todo en la carne donde persiste largo tiempo, por lo que es importante una buena desinfecci贸n, entre los desinfectantes recomendados est谩n el hipoclorito de sodio compuestos de yodo y de amonio cuaternario y se recomienda utilizar acaricidas para el control de garrapatas que como se dijo anteriormente es un vector importante en la diseminaci贸n de esta enfermedad (CResa 2010).

Normatividad

Esta enfermedad est谩 enlistada en el C贸digo Sanitario para los Animales Terrestres de la Organizaci贸n Mundial de Sanidad Animal (OIE) y es de declaraci贸n obligatoria a la OIE 驴Pero c贸mo hacer la declaraci贸n? Todos los requisitos para la notificaci贸n de la enfermedad pueden consultarse en el C贸digo Sanitario para los Animales Terrestres de la OIE (OIE 2018)

La 87a Sesi贸n general de la OIE (24 de mayo 2019) fue de gran oportunidad para la presentaci贸n de la situaci贸n de la sanidad animal mundial, esta sesi贸n adem谩s de describir la situaci贸n de otras enfermedades, se habl贸 de la PPA, pues es de alta preocupaci贸n para ciertas regiones mundiales pues causa grandes p茅rdidas, econ贸micas y ocasiona barreras sanitarias que afectan el comercio, la OIE recomienda la mayor bioseguridad con procedimientos adecuados.

Actualmente se est谩n evaluando algunas vacunas experimentales para la PPA.

BIBLIOGRAF脥A

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    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5844645/
  • Oura C.A. Virological diagnosis of African swine fever:Comparative study of available tests. Elsevier. Trinidad y Tobago;2012[Consultado 15 mayo 2019
  • Disponible en:
    https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016817021200411X

Art铆culo publicado en Los Porcicultores y su Entorno

Source: bmeditores.mx

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