Experiencias pr谩cticas en el diagn贸stico de la infecci贸n de la bolsa de fabricio

AgroMatrix Systems for Agricultural Marketing

MVZ. MC. Carlos Valladares de la Cruz
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Introducci贸n

En las aves dom茅sticas la competencia inmunol贸gica es especialmente importante para el desempe帽o productivo de la parvada; cuando las aves est谩n inmunocomprometidas la eficiencia productiva disminuye, la efectividad de las vacunas utilizadas rutinariamente se reduce y se incrementa la susceptibilidad hacia otros agentes pat贸genos

Las alteraciones en los mecanismos de resistencia natural y de inmunidad pueden ser causadas por factores medioambientales adversos como temperaturas fuera de la zona de confort, densidad excesiva, restricciones alimenticias y manejo inadecuado de la parvada. Otros agentes nocivos para el sistema inmunol贸gico son los desechos industriales y agr铆colas, as铆 como las toxinas de origen microbiol贸gico, particularmente las producidas por los hongos. Existen adem谩s agentes infecciosos capaces de alterar la capacidad funcional del sistema inmunol贸gico de las aves, como los virus causantes de la Infecci贸n de la bolsa de Fabricio, Enfermedad de Marek, Anemia Infecciosa Aviar, Leucosis Aviar y la Reticuloendoteliosis.

Cada uno de estos agentes inmunodepresores pueden actuar de manera individual, sin embargo, bajo condiciones de explotaci贸n comercial, se pueden presentar de manera simult谩nea y esto puede provocar efectos aditivos, sin茅rgicos y/o potencializadores adversos sobre la capacidad de respuesta del sistema inmune y sobre la productividad de la parvada.

La Infecci贸n de la Bolsa de Fabricio

La Infecci贸n de la bolsa de Fabricio (IBF) o Enfermedad de Gumboro es una enfermedad aguda altamente contagiosa de pollos j贸venes caracterizada por una destrucci贸n severa de los linfocitos de la bolsa de Fabricio. El virus de la IBF es un virus RNA de doble banda, de la familia Birnaviridae, g茅nero Avibirnavirus, y es probablemente el virus inmunodepresor m谩s importante de la industria av铆cola. Debido a que el virus es altamente resistente a las medidas convencionales de limpieza y desinfecci贸n de las casetas, una vez establecido en la granja tiende a persistir indefinidamente mientras las casetas se est谩n utilizando.

Los pollos criados bajo condiciones comerciales tienen elevadas posibilidades de exponerse al virus de IBF en las fases m谩s tempranas de su vida. Los efectos de la infecci贸n viral var铆an enormemente dependiendo tanto de las caracter铆sticas de las aves expuestas (estirpe, edad, grado de inmunidad materna), del tipo y manejo de la explotaci贸n, as铆 como de las caracter铆sticas del virus infectante.

De acuerdo a su patogenicidad, el virus de IBF (VIBF) puede ser clasificado en tres grupos principales: VIBF subcl铆nico, VIF cl谩sico virulento y VIBF muy virulento, ya que el virus posee gran variabilidad gen茅tica que se traduce en grados variables de virulencia, seg煤n el da帽o que producen en la bolsa, los signos cl铆nicos y la mortalidad. Gran parte de estas caracter铆sticas est谩n codificadas en la regi贸n hipervariable del gene de la prote铆na VP2. Las cepas de IBF subcl铆nicas causan inmunodepresi贸n pero no producen signos ni causan mortalidad. Las cepas de IBF cl谩sicas virulentas causan inmunodepresi贸n con alta morbilidad pero baja mortalidad. Las cepas muy virulen- tas son cepas de tipo est谩ndar que no presentan cambios antig茅nicos significativos, sin embargo, la virulencia de estas cepas est谩 incrementada, causan rangos elevados de morbilidad y mortalidad y las aves que sobreviven a la infecci贸n tambi茅n est谩n inmunodeprimidas. Desde 1987 se han reportado brotes agudos y muy severos de la enferme- dad en Europa, Asia y 脕frica, y posteriormente en Am茅rica Latina. En 1995 durante la Sesi贸n General n煤mero 63 de la Organizaci贸n Mundial de Salud Animal (OIE), el 80% de los pa铆ses miembros han reportado casos muy virulentos de la enfermedad. En M茅xico el cuadro muy virulento de la Infecci贸n de la bolsa de Fabricio a煤n no ha sido reportado.

Antig茅nicamente se han identificado dos serotipos, pero s贸lo el Serotipo 1 es naturalmente pat贸geno para los pollos. Dentro del Serotipo 1 existen 2 grupos principales del VIBF, los virus Est谩ndar y los virus Variantes. En el grupo de los virus Est谩ndar se incluyen las cepas cl谩sicas virulentas, las cepas muy virulentas y las cepas vacunales (Figura 1).

El grupo de los virus Variantes est谩 compuesto por cepas antig茅nicamente distintas que generalmente no producen signos pero causan atrofia bursal severa. Las cepas Variantes son capaces de infectar y causar enfermedad en pollos con niveles elevados de anticuerpos contra las cepas Est谩ndar, los sueros de aves vacunadas con cepas Est谩ndar tienen una capacidad limitada de neutralizar a las cepas Variantes. La secuenciaci贸n gen茅tica del gene de la prote铆na VP-2 es m茅todo m谩s confiable para la identificaci贸n y diferenciaci贸n de las cepas del VIBF. Variantes del VIBF aisladas en Estados Unidos y Latinoam茅rica muestran cambios (鈥渄rifts鈥) antig茅nicos que afectan la neutralizaci贸n de los ep铆topes de la prote铆na de la c谩pside VP2. En estudios realizados en Georgia, EUA, se detect贸 que el 80% de las cepas de Estados Unidos fueron variante tipo Delaware E y el 8% similar a Variante E; en Republica Dominicana y Ecuador se detectaron cepas similares a la variante Delaware E, en Per煤 y Venezuela se detectaron tipos Delaware y GLS, mientras que en Brasil y Rep煤blica Dominicana se detectaron cepas cl谩sicas de alta virulencia, de las muestras procedentes de M茅xico 6 correspondieron a cepas est谩ndar y 3 no fueron tipificables con el sistema utilizado. En otro estudio realizado en la Universidad de Ohio, a partir de muestras procedentes de M茅xico, se encontraron cepas Variantes cercanas al grupo Delaware E, cepas cl谩sicas virulentas y cepas variantes cercanas a cepas cl谩sicas. Las cepas variantes prevalentes en los Estados Unidos, contin煤an sufriendo modificaciones gen茅ticas. Actualmente se han detectado diversos grupos filogen茅ticos, sin embargo, no se ha establecido completamente s铆 han ocurrido cambios significativos en sus caracter铆sticas antig茅nicas. Es posible que los virus detectados en Am茅rica Latina fueran originados de las cepas de los Estados Unidos debido a las similitudes gen茅ticas observadas entre ambos grupos de virus.

Cuadro Cl铆nico

La enfermedad tiene dos formas de presentaci贸n: cl铆nica y subcl铆nica, que est谩n determinadas por la edad cuando ocurre la infecci贸n, por la virulencia de la cepa viral involucrada y por el grado de inmunidad de las aves infectadas.

En Latinoam茅rica y en los Estados Unidos la presentaci贸n m谩s importante de la enfermedad ocurre como un cuadro subcl铆nico. Esta presentaci贸n cursa con atrofia severa e irreversible de la bolsa de Fabricio, lo que genera un estado permanente de inmunodepresi贸n que produce fallas vacunales y un incremento en la susceptibilidad hacia las enfermedades infecciosas (colibacilosis, coccidiosis, hepatitis con cuerpos de inclusi贸n, enfermedad de Marek, etc.). La inmunodepresi贸n que se presenta es debida a defectos en la inmunidad humoral y en la producci贸n de anticuerpos; los efectos sobre la inmunidad celular son leves y transitorios. La gravedad del da帽o sobre el sistema inmune depende del momento de la vida del ave en el que ocurre la infecci贸n, entre m谩s joven sea el ave la inmunodepresi贸n resultante ser谩 m谩s severa.

La forma subcl铆nica de la IBF es producida por la infecci贸n de cepas variantes usualmente en aves menores a tres semanas de edad. Infecciones por cepas cl谩sicas de virulencia moderada pueden tambi茅n causar la forma subcl铆nica de la enfermedad, sobre todo en aves infectadas menores a dos semanas de edad.

El diagn贸stico del cuadro subcl铆nico de la enfermedad de Gumboro basado en los signos es dif铆cil ya que no hay signos espec铆ficos de la enfermedad; sin embargo existen indicadores generales que sugieren un problema de inmunodepresi贸n en la parvada, como un desarrollo productivo deficiente (peso final al mercado, ganancia de peso, conversi贸n alimenticia, 铆ndices de productividad bajos); aumento en la incidencia de complicaciones en las enfermedades respiratorias; aumento en la severidad de las reacciones post vacunales, respuestas serol贸gicas menores a lo esperado en las vacunaciones rutinarias y aumento en la incidencia de enfermedades oportunistas( hepatitis con cuerpos de inclusi贸n, dermatitis gangrenosa, colibacilosis).

La presentaci贸n cl铆nica de la enfermedad de Gumboro es producida por cepas de tipo Est谩ndar (llamadas Cl谩sicas) o por cepas de alta virulencia. Esta forma generalmente se presenta en aves de tres a seis semanas. Las aves presentan un cuadro caracterizado por diarrea acuosa y blanquecina (diuresis), anorexia, depresi贸n y erizamiento de las plumas. Las aves afectadas con este cuadro cl铆nico presentan lesiones en la bolsa de Fabricio caracter铆sticas. En los estadios iniciales de la enfermedad se observa un aumento de tama帽o de la bolsa, seguido de un edema acuoso marcado en la serosa, edema que m谩s tarde se torna gelatinoso y de un color amarillento. En los casos avanzados de la enfermedad, la bolsa puede presentar algunas hemorragias. Pueden observarse hemorragias en la musculatura de las extremidades inferiores.

Los cuadros muy severos de la enfermedad son producidos por cepas de Tipo Est谩ndar denominadas 鈥淢uy Virulentas鈥 y se caracterizan por provocar un aumento s煤bito y severo de la mortalidad, que puede alcanzar niveles tan elevados como del 70%. En las etapas finales de la enfermedad es com煤n observar tremores, postraci贸n; deshidrataci贸n severa e hipotermia. En estos casos la bolsa de Fabricio presenta hemorragias severas que se pueden observar tanto en la mucosa como en la serosa de la bolsa (Figura 2). Las hemorragias tambi茅n se observan de forma generalizada en la musculatura de las extremidades inferiores y en algunos casos en la pechuga. Otras lesiones frecuentes son nefritis, nefrosis y deshidrataci贸n.

Figura 2- Hemorragias severas en la mucosa bursal por infecci贸n por un virus muy virulento de la Infecci贸n de la bolsa de Fabricio (Villegas y Banda, 2006).

El Diagn贸stico de la Infecci贸n de la Bolsa de Fabricio.

El uso del laboratorio es esencial para el diagn贸stico de la Infecci贸n de la bolsa de Fabricio y para la evaluaci贸n de los programas de protecci贸n contra la enfermedad. Para que los estudios de laboratorio sean efectivos, deben ser constantes, es probable que los cambios en el comportamiento de las parvadas que se observan por cambios en la vacunaci贸n contra IBF no sean ni dr谩sticos ni inmediatos en la primer parvada, sino que m谩s bien se establecen en forma gradual y progresiva. La interpretaci贸n de un s贸lo grupo de resultados es dif铆cil y puede conducir a conclusiones err贸neas.

No es necesario hacer un estudio extensivo a un gran n煤mero de aves, pero s铆 es muy importante que las aves a analizar sean representativas del estado general de la parvada, la representatividad de los resultados depende en gran medida de la representatividad de las muestras colectadas. Se requiere tambi茅n que la metodolog铆a del muestreo sea constante.

Es preferible usar el mismo laboratorio y que se usen las mismas t茅cnicas, los mismos reactivos y personal constante para minimizar los errores atribuibles a los procedimientos utilizados. Las t茅cnicas usadas deben estar estandarizadas y dar resultados que se puedan cuantificar, adem谩s deben ser pr谩cticas, accesibles y no ser demasiado costosas; las ventajas que se deber谩n obtener con su uso deber谩n ser superiores a los costos que implica el uso del Laboratorio de Diagn贸stico.

En t茅rminos generales, las t茅cnicas de diagn贸stico son las siguientes:

  1. Aislamiento viral in vitro.
  2. Aislamiento viral in vivo.
  3. Detecci贸n de ant铆genos virales en la bolsa.
  4. Serolog铆a.
  5. Histopatolog铆a.
  6. Biolog铆a molecular.

a) AISLAMIENTO VIRAL IN VITRO.

El virus de IBF est谩 presente en la mayor铆a de los 贸rganos linfoides, sin embargo en la bolsa de Fabricio es donde se encuentra en mayor cantidad y por m谩s tiempo, as铆 que es la muestra de elecci贸n para realizar el aislamiento viral. El VIBF puede ser aislado in vitro por inoculaci贸n en embriones de pollo libres de anticuerpos contra el VIBF. La membrana corioalantoidea (MCA) es la v铆a de inoculaci贸n m谩s efectiva aunque el virus tambi茅n puede ser aislado inoculando por v铆a del saco vitelino (SV). Las lesiones embrionarias y la mortalidad tras la inoculaci贸n var铆an de acuerdo al patotipo de virus aislado. Las cepas cl谩sicas inoculadas por MCA producen muerte embrionaria en 3 a 5 d铆as y los embriones presentan congesti贸n y hemorragias petequiales en los fol铆culos de las plumas, las articulaciones de los dedos y en el 谩rea cerebral; el h铆gado puede presentar necrosis. Las cepas variantes pueden crecer cuando son inoculadas por v铆a CAM pero no producen muerte embrionaria, por lo que los embriones deben ser revisados 7 d铆as despu茅s de la inoculaci贸n para detectar edema cerebral y abdominal de color blanquecino, enanismo y focos de necrosis en el h铆gado, los embriones no presentan congesti贸n o hemorragias. Aunque el aislamiento inicial del virus es mejor por inoculaci贸n en embri贸n de pollo, el virus puede ser adaptado a cultivo celular y crecer en l铆neas celulares embrionarias de bolsa de Fabricio, c茅lulas renales y fibroblastos, produciendo efectos citop谩ticos. El aislamiento viral in vitro no es una prueba frecuentemente utilizada para el diagn贸stico de IBF.

b) AISLAMIENTO VIRAL IN VIVO.

Una alternativa para facilitar el aislamiento viral es la inoculaci贸n de aves sin anticuerpos anti VIBF de 3 semanas de edad con un macerado de tejido bursal sospechoso administrado por v铆a oral. El cuadro cl铆nico se reproducir谩 en las aves de 3 a 5 d铆as post inoculaci贸n y las bolsas de estas aves pueden ser usadas para la inoculaci贸n de embriones de pollo libres de anticuerpos anti VIBF.

c) DETECCI脫N DE ANT脥GENOS VIRALES EN LA BOLSA.

Una manera r谩pida de detecci贸n del virus de IBF es la demostraci贸n de ant铆genos virales en la bolsa de Fabricio. Existen pruebas de inmunofluorescencia directa e indirecta y de inmunohistoqu铆mica que han demostrado su eficacia, aunque la disponibilidad de los antisueros marcados puede ser una limitante. Es posible la realizaci贸n de una prueba de precipitaci贸n en agar para demostrar la presencia del virus utilizando un macerado de bolsas de aves en la fase aguda de la enfermedad y enfrent谩ndolo a un antisuero conocido contra el VIBF. Existe tambi茅n un sistema de ELISA de captura de Ant铆geno que ha sido utilizado para la detecci贸n y la caracterizaci贸n del VIBF a partir de macerado de tejido bursal.

Figura 3.- Perfil de anticuerpos contra el VIB en reproductoras comerciales en producci贸n, en 3 edades (Valladares y col. 2009).

d) SEROLOG脥A.

La serolog铆a es un 谩rea importante de investigaci贸n de la enfermedad y existen varias t茅cnicas disponibles para la cuantificaci贸n de los anticuerpos en el suero. Actualmente las pruebas de ensayo inmunoenzim谩tico (ELISA) y de virus suero neutralizaci贸n (VSN) son las m谩s utilizadas.

La prueba de ELISA es la prueba m谩s usada en los laboratorios de diagn贸stico. La prueba de ELISA no es espec铆fica de serotipo y detecta anticuerpos tanto del serotipo 1 como del serotipo 2 y no permite la diferenciaci贸n de anticuerpos contra diferentes subtipos antig茅nicos ya que utiliza virus completos como ant铆genos. Los resultados de la prueba de ELISA no siempre est谩n correlacionados con los de la prueba de VSN. La prueba de ELISA tiene las ventajas de ser r谩pida, relativamente f谩cil de hacer y requiere de cantidades m铆nimas de suero para su realizaci贸n, as铆 mismo, permite que los resultados sean f谩cilmente exportables a un software que permite f谩cilmente almacenar y organizar los resultados en una base de datos, para hacer comparaciones y an谩lisis estad铆sticos. Existen varios estuches disponibles comercialmente para la realizaci贸n de la prueba.

El uso generalizado de la t茅cnica de ELISA permite conocer el perfil serol贸gico esperado de las parvadas y establecer los par谩metros normales o 鈥渓铆neas de base鈥, por medio de estudios estad铆sticos de los resultados a trav茅s del tiempo, de acuerdo a las caracter铆sticas propias de cada empresa.

Esta informaci贸n puede clasificar los muestreos particulares como altos, normales o por debajo del nivel esperado de anticuerpos en la parvada (Figura 3). En an谩lisis de los resultados de la prueba de ELISA permite analizar el desempe帽o de los esquemas de vacunaci贸n, determinar la magnitud de la exposici贸n hacia virus de campo; predecir los niveles de inmunidad materna en la progenie y determinar la edad m谩s adecuada para la primera vacunaci贸n, generalmente los t铆tulos serol贸gicos de la progenie reci茅n nacida son un 60-80% m谩s bajos que en las reproductoras de origen. Despu茅s del nacimiento, los niveles de anticuerpos son variables dependiendo de la edad de las aves e indican cu谩l ha sido la respuesta serol贸gica hacia el virus. No necesariamente pueden indicar por s铆 solos un nivel de protecci贸n, particularmente en aves mayores de tres semanas. Un t铆tulo elevado de anticuerpos puede indicar buena protecci贸n o bien evidenciar un fuerte desaf铆o de campo y que las aves no han resistido dicho desaf铆o.

La prueba de virus suero neutralizaci贸n es el m茅todo m谩s sensible para la detecci贸n de anticuerpos contra el VIBF. La prueba se realiza en un sistema de micro titulaci贸n usando como ant铆geno un virus adaptado al crecimiento en cultivo celular y fibroblastos de embri贸n de pollo. La prueba de VSN es cuantitativa y es la 煤nica prueba serol贸gica que puede ayudar a diferenciar entre diferentes serotipos y subtipos antig茅nicos del VIBF. La mayor铆a de los sueros de los pollos en condiciones de campo tienen un nivel elevado de anticuerpos neutralizantes contra un amplio espectro de virus antig茅nicamente diversos debido a la combinaci贸n de exposiciones de campo, exposiciones vacunales y a las reacciones cruzadas que se observan cuando el nivel de anticuerpos es elevado. La realizaci贸n de la prueba de VSN es compleja, relativamente costosa, consume m谩s tiempo y no permite la evaluaci贸n de una gran cantidad de sueros de manera simult谩nea.

Figura 4. Corte histol贸gico de bolsa de Fabricio para la determinaci贸n del 鈥淕rado de Lesi贸n Linfoide Bursal鈥 (Valladares, 2007).

La prueba de precipitaci贸n en agar (AGP) puede ser usada para la detecci贸n y cuantificaci贸n de anticuerpos en aves convalecientes, pero su sensibilidad es baja.

Ninguna de las pruebas serol贸gicas disponibles actualmente pueden tipificar de manera precisa y contundente el tipo de cepa que afecta a las aves en el campo.

e) HISTOPATOLOG脥A.

El tejido blanco del VIBF es la bolsa de Fabricio, el estudio histol贸gico de la bolsa permite determinar el grado de lesi贸n que tiene la bolsa despu茅s de una infecci贸n. Si bien, las lesiones bursales no son exclusivas de las infecciones por el VIBF, son bastante caracter铆sticas, predecibles y tienen un elevado grado de correlaci贸n con los patotipos del virus. La intensidad de las lesiones bursales es un reflejo del grado de protecci贸n de las aves ante un desaf铆o de campo, particularmente del tejido linfoide bursal, que es el tejido funcional de la bolsa.

Si bien los estudios histopatol贸gicos son fundamentalmente descriptivos, algunos investigadores han desarrollado sistemas semicuantitativos con escalas arbitrarias de evaluaci贸n del da帽o bursal, para hacer comparaciones entre diversos casos, con criterios particulares de cada investigador.

La evaluaci贸n histol贸gica debe incluir tanto la extensi贸n del tejido da帽ado (distribuci贸n de la lesi贸n), as铆 como la intensidad de la lesi贸n sobre el tejido linfoide. El curso de la lesi贸n es importante para determinar la duraci贸n del proceso y la etapa de la infecci贸n viral.

Nosotros hemos desarrollado un sistema de evaluaci贸n de las lesiones microsc贸picas bursales. Las lesiones son identificadas y descritas con cuatro criterios principales: tipo de lesi贸n, curso de la lesi贸n, distribuci贸n e intensidad. Posteriormente las lesiones son calificadas en una escala num茅rica a los criterios de distribuci贸n (como proporci贸n de tejido afectado) y de intensidad (severidad) tomando como criterio principal el estado del tejido linfoide bursal. En este sistema se eval煤a cada bolsa en un corte transversal por su eje mayor, te帽ido con una coloraci贸n convencional de Hematoxilina & Eosina (Figura 4). Se recomienda la observaci贸n de muestras de por lo menos 10 aves de la misma parvada, seleccionadas al azar. La observaci贸n de las muestras se realiza individualmente. El promedio de la evaluaci贸n de las 10 bolsas se denomina 鈥淕rado de Lesi贸n Linfoide Bursal鈥.

La escala arbitraria del 鈥淕rado de lesi贸n Linfoide Bursal鈥 es de 0 a 7; donde valores de 0 se consideraron sin lesiones, valores entre 0.1 y 2.5 como lesiones leves, valores mayores de 2.6 y menores de 6 como lesiones moderadas y valores entre 6 y 7 se consideraron lesiones severas. De acuerdo al siguiente criterio.

A.- Tipo de lesi贸n y Curso de la lesi贸n:
El tejido linfoide bursal tiene una capacidad relativamente estrecha para responder a la agresi贸n, los cambios m谩s importantes son:

  1. Afectaciones en la densidad celular, que usualmente se refieren a una disminuci贸n de la densidad de los linfocitos en los fol铆culos linfoides, esta lesi贸n se conoce como depleci贸n linfoide (del ingl茅s 鈥渄epletion鈥 = disminuci贸n, reducci贸n, merma). La depleci贸n linfoide usualmente se inicia en la zona medular y posteriormente afecta a la zona cortical; la disminuci贸n en el n煤mero de c茅lulas linfoides se manifiesta por baja celularidad, aspecto vacuolar del tejido y/o por la presencia de c茅lulas reticulares que usualmente no son visibles en los cortes de los tejidos sin lesiones. La intensidad de la lesi贸n es generalmente de leve a moderada. Eventualmente se observan cambios adaptativos en la densidad celular con un incremento en el tama帽o folicular por aumento del n煤mero de linfocitos en un fol铆culo individual, a esta lesi贸n se le denomina hiperplasia folicular y usualmente es compensatoria a una destrucci贸n extensa del tejido linfoide. La intensidad de la lesi贸n puede ser de leve a moderada.
  2. Da帽o en la integridad del tejido linfoide, con muerte y destrucci贸n de linfocitos. Esta lesi贸n se denomina necrosis linfoide y su distribuci贸n puede ser focal, extensiva o difusa. La intensidad de la lesi贸n suele ser de moderada a severa.
  3. Inflamaci贸n del tejido bursal, es una respuesta que se observa tras una agresi贸n severa, se denomina Bursitis y de acuerdo a sus caracter铆sticas histol贸gicas puede ser hiperaguda, aguda, subaguda o cr贸nica. Las lesiones hiperagudas y agudas se caracterizan por cambios vasculares como edema que inicia siendo subepitelial y posteriormente se extiende hacia los espacios interfoliculares; congesti贸n y hemorragias, que se localizan preferentemente en las puntas de las plicas; los casos m谩s severos se caracterizan por marcada infiltraci贸n heterofila; la lesi贸n tisular m谩s importante es la necrosis linfoide. En las lesiones subagudas los cambios vasculares son menos evidentes; la necrosis linfoide empieza a ser sustituida por las c茅lulas del estroma subyacente y se inician los cambios de reparaci贸n que pueden ser regenerativos o fibrosantes, dependiendo de la gravedad del proceso. El cuadro cr贸nico se caracteriza por atrofia del tejido linfoide, proliferaci贸n del tejido conjuntivo interfolicular y proliferaci贸n del epitelio superficial y ocasionalmente del epitelio corticomedular, dando en ocasiones un aspecto adenoide a la bolsa. La bursitis cr贸nica se considera irreversible cuando se pierde total- mente la arquitectura de los fol铆culos linfoides y no hay posibilidad de regeneraci贸n, los fol铆culos se pierden permanentemente; ocasionalmente la arquitectura foli- cular no se pierde por completo y se puede observar la regeneraci贸n de algunos fol铆culos, particularmente los que est谩n localizados en la base de las plicas, sufriendo 茅stos una hiperplasia compensatoria. La inflamaci贸n del tejido bursal generalmente se presenta en forma difusa pero tambi茅n puede ser extensiva. La intensi- dad de la lesi贸n es de moderada a severa.

Los t茅rminos patol贸gicos hiperagudo, agudo, subagudo聽y cr贸nico son t茅rminos descriptivos para caracterizar a la lesi贸n, de acuerdo a la respuesta vascular y tisular que se observan tras la agresi贸n. Estos t茅rminos no necesariamente corresponden al criterio cl铆nico de agudo y cr贸nico.

El tipo de Lesi贸n y el Curso de la lesi贸n son t茅rminos descriptivos para caracterizar a la lesi贸n y se utilizan para obtener el diagn贸stico histol贸gico.

La cuantificaci贸n num茅rica para obtener el 鈥淕rado de Lesi贸n Linfoide Bursal鈥, toma en cuenta los criterios de distribuci贸n y la intensidad de la lesi贸n.

B. Distribuci贸n: La distribuci贸n de las lesiones puede ser focal, multifocal, extensiva o difusa, y considera la proporci贸n del tejido afectado con respecto a la superficie total observada.

Para la determinaci贸n del 鈥淕rado de Lesi贸n Linfoide Bursal鈥 la proporci贸n del tejido afectado puede tener un valor num茅rico arbitrario de 0 a 4, seg煤n la proporci贸n de los fol铆culos afectados, donde:

0 = sin lesiones
1 = hasta un 25% de los fol铆culos afectados
2 = hasta un 50% de los fol铆culos afectados
3 = hasta un 75% de los fol铆culos afectados, y 4 = hasta un 100% de los fol铆culos afectados.

C. Intensidad de la lesi贸n: La Intensidad de la lesi贸n est谩 determinado por el nivel de destrucci贸n de los linfo- citos de los fol铆culos linfoides; puede ser nulo, leve, moderado o severo.

Para la determinaci贸n del 鈥淕rado de Lesi贸n Linfoide Bursal鈥 la Intensidad de la lesi贸n puede tener un valor arbitrario de 0 a 3 donde:

0 = sin lesiones
1 = leve, existe disminuci贸n de la densidad celular y del n煤mero de c茅lulas linfoides de los fol铆culos, o bien la presencia de necrosis en algunos linfocitos de la zona medular.
2 = moderado, existe desaparici贸n celular y necrosis individual de linfocitos, pero la arquitectura celular b谩sica de los fol铆culos es mantenida; generalmente se observan otros cambios tisulares indicativos de un proceso inflamatorio, ya sea agudo o subagudo (congesti贸n vascular y edema).
3 = severo, la arquitectura de los fol铆culos se pierde, la necrosis es extensiva y abarca tanto a la zona medular como a la zona cortical, el estroma del tejido est谩 tambi茅n afectado, los cambios inflamatorios son severos y su naturaleza var铆a de acuerdo al curso del proceso y la inflamaci贸n puede ser aguda o cr贸nica.

La determinaci贸n del 鈥淕rado de Lesi贸n Linfoide Bursal鈥 se obtiene para cada una de las bolsas analizadas sumando los valores obtenidos con la Distribuci贸n y con la Intensidad de la Lesi贸n, en una escala continua de 0 a 7, donde 0 es el valor m铆nimo y 7 es el valor m谩ximo. Y resulta de la suma de las evaluaciones de Distribuci贸n e Intensidad de la lesi贸n.

Distribuci贸n (escala de 0 a 4) + Grado (escala de 0 a 3)

Se recomienda hacer este estudio en por lo menos 10 aves exactamente de la misma edad.

Se obtiene un diagn贸stico morfol贸gico microsc贸pico describiendo la lesi贸n predominante de cada bolsa con distribuci贸n, curso, grado y proporci贸n del total muestreado, indicando el n煤mero de bolsas que presentan dicha lesi贸n.

Finalmente se obtiene el 鈥淕rado de Lesi贸n Linfoide Bursal鈥 con el promedio aritm茅tico del total de observaciones.

La interpretaci贸n del 鈥淕rado Promedio de Lesi贸n Linfoide Bursal禄 es la siguiente:

SIN LESION: 0
GRADO DE LESION LEVE: de 0.1 a 2.5
GRADO DE LESION MODERADA: de 2.6 a 5.9
GRADO DE LESION SEVERA: de 6.0 a 7.0

Ejemplo:

Diagn贸stico histopatol贸gico: sin lesiones 2/10; depleci贸n linfoide medular, difusa, moderada 3/10; bursitis aguda, difusa, severa 5/10.

Evaluaci贸n cuantitativa:

  • sin lesiones (distribuci贸n 0% = 0), (intensidad = 0):
    0 x 2 bolsas = 0
  • depleci贸n linfoide medular, multifocal (distribuci贸n
    50%= 2), moderada (intensidad = 1.5): 2 + 1.5 = 3.5 x
    3 bolsas = 9.5
  • bursitis aguda, difusa: (distribuci贸n 100% = 4), severa (intensidad = 2.8) 4 + 2.8 = 6.8 x 5 bolsas = 34 Grado Promedio de Lesi贸n Linfoide Bursal = 0 + 9.5 +
    34 = 43.5/10 = 4.35

El promedio del grado de lesi贸n bursal es 4.35, lo que clasificar铆a al grado de agresi贸n bursal como moderado, donde 5 bolsas estaban muy lesionadas, 3 bolsas ten铆an lesiones leves y 2 bolsas no ten铆an lesiones.

Figura 5. Grado de Lesi贸n Linfoide Bursal durante 2006, 2007 y 2008 en 26,100 muestras de pollo de engorda de 2掳 a 6掳 semana de edad (Valladares y col. 2008).

Interpretaci贸n del Grado de Lesi贸n Linfoide Bursal:

El grado de lesi贸n linfoide bursal puede ser indicativo del nivel de protecci贸n de la parvada contra la Enfermedad de Gumboro. Entre menor sea el grado promedio de lesi贸n bursal detectado, se interpreta como una mayor protecci贸n contra los desaf铆os de campo (o bien que no ha habido fuertes desaf铆os de campo en la granja).

Es dif铆cil encontrar grados de lesi贸n de 0 sobre todo en aves mayores de 4 semanas. Las observaciones realizadas hasta una semana despu茅s de una vacunaci贸n con un virus vivo normalmente resultan en grados promedio de lesi贸n menores a 2. Una parvada bien protegida tendr谩 grados promedio de lesi贸n bursal menores a 3.5 por lo menos hasta la 5a semana de edad, despu茅s de la 6a semana el grado promedio de lesi贸n bursal tiende a elevarse progresivamente, normalmente hasta un valor de 4. Grados promedio de lesi贸n bursal superiores a 6 indican una agresi贸n severa sobre el tejido bursal y denotan que el desaf铆o de campo ha logrado superar el grado de protecci贸n del sistema inmune hacia el virus de Gumboro; en estos casos es muy importante detectar la edad a la que estas lesiones est谩n siendo detectadas; las lesiones agudas tardan aproximadamente 4-5 d铆as en desarrollarse por lo que 4-5 d铆as antes de la detecci贸n de la lesi贸n aguda es cuando el desaf铆o de campo ha superado la barrera inmunol贸gica; entre m谩s tard铆o sea este cambio denotar谩 una mejor protecci贸n de la parvada.

En un estudio de tres a帽os de duraci贸n se analizaron 26,100 muestras de tejido bursal de pollo de engorda muestreados semanalmente desde la 2掳 hasta la 6掳 semana de edad; los estudios histopatol贸gicos indican que la infecci贸n se establece en las parvadas entre la tercera y la cuarta semana de edad y tienen un nivel m谩ximo de lesi贸n alrededor de la 5掳 semana de edad (Figura 5).

Correlaci贸n de los hallazgos histopatol贸gicos con los resultados de serolog铆a: la interpretaci贸n de los resultados es m谩s precisa si se utilizan varias pruebas, como la serolog铆a y la histopatolog铆a. Una vez que se ha establecido este sistema de Monitoreo y se conocen las caracter铆sticas de la Enfermedad de Gumboro en una zona determinada, el sistema puede usarse para establecer diferencias entre los diferentes calendarios de vacunaci贸n o entre los diferentes productos a utilizar para la protecci贸n de los pollos de engorda.

En otro estudio se compararon los resultados de serolog铆a e histopatolog铆a durante 1 a帽o de 2 empresas con calendarios de vacunaci贸n diferentes. La empresa A ten铆a par谩metros productivos buenos de acuerdo a la zona, mientras que la empresa B ten铆a par谩metros productivos deficientes de acuerdo a la zona.

En la empresa A se hicieron 320 estudios en un lapso de un a帽o. El t铆tulo promedio para IBF en pollos de 1 a 3 d铆as fue de 3,608 (CV 36%), en la 4o semana el t铆tulo promedio fue de 225 (CV 24%), en la 6a semana el t铆tulo promedio fue de 3,469 (CV 52%). El grado promedio de lesi贸n bursal fue 0.25 en los primeros 3 d铆as, 2.2 en la 4a semana y 5.4 en la 6o semana, donde el predominio de las lesiones fue la bursitis aguda.

En la empresa B se hicieron 285 estudios en un lapso de un a帽o. El t铆tulo promedio para IBF en pollos de 1 a 3 d铆as fue de 4,032 (CV 46%), en la 4掳 semana el t铆tulo promedio fue de 526 (CV 172%), en la 6a semana el t铆tulo promedio fue de 3,826 (CV 49%). El grado promedio de lesi贸n bursal fue de 0.18 en los primeros 3 d铆as, 4.9 en la 4a semana donde el predominio de las lesiones fue bursitis aguda difusa de moderada a severa y 6.7 en la 6o semana, donde el predominio de las lesiones fue la bursitis cr贸nica.

Aunque los resultados de serolog铆a son aparentemente similares en ambos casos, la empresa A tuvo lesiones leves a la 4掳 semana y lesiones moderadas a la 6掳 semana, mientras que la empresa B tuvo lesiones moderadas a la 4掳 semana y lesiones severas a la 6掳 semana. Lo que indica que la empresa A tuvo un nivel de protecci贸n del tejido bursal m谩s efectivo por lo menos durante dos semanas (Cuadro 1).

En otro estudio se compararon dos vacunas vivas en un calendario comercial en una granja de 72,000 aves. El calendario de vacunaci贸n consisti贸 en Enfermedad de Marek e IBF por v铆a subcut谩nea al primer d铆a y una revacunaci贸n contra IBF el d铆a 14 en el agua de bebida, usando dos productos diferentes (A y B). Se realizaron estudios de ELISA e histopatolog铆a de la bolsa de Fabricio semanalmente. La Vacuna A indujo lesiones moderadas 3.4) 5 d铆as despu茅s de su aplicaci贸n, el calendario protegi贸 por lo menos hasta la 4a semana, en la 6a semana hubo lesiones cr贸nicas moderadas con un inicio en la elevaci贸n de los t铆tulos, para la 8a semana las lesiones presentaron cierta regresi贸n. La vacuna B indujo lesiones leves (1.30) 5 d铆as despu茅s de su aplicaci贸n, el calendario protegi贸, por lo menos hasta la 6a semana, resultando el muestreo sin lesiones y sin seroconversi贸n, para la 8a semana se observaron lesiones cr贸nicas severas (6.40) y seroconversi贸n. Los par谩metros productivos fueron mejores con la vacuna B que con la vacuna A.

F) BIOLOG脥A MOLECULAR.

La detecci贸n y tipificaci贸n de las cepas del VIBF es importante para establecer las bases de los programas de control de la enfermedad y para determinar, por ejemplo, si los calendarios de vacunaci贸n utilizados pueden proteger contra los subtipos de virus presentes en el medio ambiente de las aves. Actualmente las pruebas de biolog铆a molecular son las m谩s precisas para la identificaci贸n y caracterizaci贸n de las cepas del VIBF.

En varios laboratorios se utiliza la t茅cnica de la Reacci贸n en Cadena de la Polimerasa acoplada a Retrotranscriptasa (RT-PCR) para detectar la presencia del virus en el tejido bursal. Despu茅s de confirmar la presencia del virus, 茅ste se puede tipificar utilizando las pruebas del Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restricci贸n (RFLP) y la prueba de Secuenciaci贸n gen茅tica de la regi贸n hipervariable del gene VP-2.

La prueba de RFLP fue de gran utilidad durante la 煤ltima d茅cada, y clasific贸 a las cepas en grupos moleculares, sin embargo con el tiempo se fueron detectando cepas que no pod铆an ser clasificadas adecuadamente con este sistema (Figura 6).

Figura 6. Clasificaci贸n de las cepas del VIBF en grupos moleculares con la prueba de RFLP (Jackwood, D. J. and Sommer, S. E. (1997).

En muestras procedentes de M茅xico estudiadas en la Universidad de Georgia, con este sistema, 6 muestras correspondieron a cepas est谩ndar y 3 no fueron tipificables (Banda y col, 2003). En otro estudio realizado en la Universidad de Ohio, a partir de muestras procedentes de M茅xico, se encontraron cepas Variantes cercanas al grupo Delaware E, cepas cl谩sicas virulentas y cepas variantes cercanas a cepas cl谩sicas (Cookson y col. 2007).

En otro estudio realizado con muestras del noreste de M茅xico (Valladares y Banda, 2003) se identificaron nueve virus con un patr贸n id茅ntico al de la cepa variante Delaware E, tres virus similares a la cepa vacunal ST-12, dos virus similares a la cepa vacunal PBG y un virus no tipificable.

La variabilidad gen茅tica que se ha detectado en las cepas del VIBF no puede ser apreciada en su totalidad usando RFLP y la tendencia actual es la utilizaci贸n de la secuenciaci贸n gen茅tica de la regi贸n hipervariable del gene de la prote铆na VP-2 (hvVP2), siendo este m茅todo el m谩s preciso en la actualidad.

La secuenciaci贸n gen茅tica permite adem谩s hacer el an谩lisis filogen茅tico de las cepas. La regi贸n hvVP2 controla la antigenicidad y es parcialmente responsable del control de la patogenicidad de las cepas del VIBF. Las cepas cl谩sicas y las cepas variantes est谩n localizadas en dos ramas diferentes del an谩lisis filogen茅tico de hvVP2; este an谩lisis tambi茅n puede identificar a las cepas muy virulentas del VIBF, aunque聽la diferenciaci贸n entre cepas subcl铆nicas y cl铆nicas no es del todo clara. En la figura 7 se observa la relaci贸n filogen茅tica de varias cepas del VIBF detectadas en Latinoam茅rica.

Figura 7. Relaci贸n filogen茅tica de cepas del VIBF procedentes de Latinoam茅rica (Villegas y Banda 2007).

Durante el a帽o 2008 se estudiaron muestras de 30 granjas de pollo de engorda del Noreste de M茅xico, para identificar y tipificar los virus de IBF, evaluar las lesiones histol贸gicas bursales y la producci贸n de anticuerpos detectados por ELISA, as铆 como su relaci贸n con los calendarios de vacunaci贸n utilizados (Valladares y col. 2008).

Con la prueba de RT-PCR se detectaron 28 VIBF. El an谩lisis de las secuencias de nucle贸tidos determin贸 que 21 virus mostraron caracter铆sticas gen茅ticas de los virus variantes Tipo Delaware E. El an谩lisis filogen茅tico de la regi贸n hvVP2 indic贸 que estos virus son gen茅ticamente similares al virus 11153 USA, que fue aislado en Georgia, USA, en el a帽o 2001 (Figura 8). La secuenciaci贸n gen茅tica de los virus detectados indica que pertenecen al Grupo Molecular 6 de la clasificaci贸n realizada por Jackwood y Sommer-Wagner (2007). El estudio histopatol贸gico mostr贸 que en las muestras de trece de estas granjas se observaron lesiones bursales severas, en cuatro granjas se presentaron lesiones moderadas, en dos granjas se observaron lesiones leves y en dos granjas no se detectaron lesiones bursales. Se detect贸 seroconversi贸n al VIBF en 11 de estas 21 granjas, 煤nicamente en aves a partir de la 4掳 semana de edad, mientras que en las 10 granjas de aves menores a 4 semanas, positivas a virus Variante, no se detect贸 seroconversi贸n al VIBF. Los virus variantes se detectaron en granjas con 4 calendarios de vacunaci贸n diferentes con cepas vacunales est谩ndar de tipo intermedio (Cuadro 3).

Figura 8. Relaci贸n filogen茅tica de VIBF Variante detectados en el Noreste de M茅xico en 2008. (Valladares y col. 2009).

Recomendaciones
Existen diversos m茅todos para realizar el diagn贸stico de la Enfermedad de Gumboro. Cada metodolog铆a posee ventajas y limitaciones. La detecci贸n e identificaci贸n de las cepas del VIBF es importante para establecer estrategias de prevenci贸n y control de la enfermedad, y que los calendarios de vacunaci贸n utilizados sean capaces de proteger contra los subtipos de virus presentes en el medio ambiente de las aves.

Art铆culo publicado en Los Avicultores y su Entorno

Source: bmeditores.mx

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